从线虫到人类：嘌呤代谢酶ADAH

核苷酸对所有生命至关重要，因此当宿主被病原体感染时，宿主与病原体之间经常会争夺核苷酸的可用性。这场争夺对于专性细胞内病原体，例如微孢子虫（Microsporidia，一种寄生性真菌）来说尤为重要。值得注意的是，微孢子虫缺乏核苷酸生物合成途径，而是利用ATP转运体在宿主细胞质中复制时“窃取”宿主核苷酸。同样，病毒通常缺乏自身的核苷酸生物合成机制，因此也依赖宿主核苷酸来合成其核酸基因组并转录其基因。

为了抵御病毒感染，许多宿主防御途径会消耗胞内存储的核苷酸。例如，在人类中，含有SAM结构域和HD结构域的蛋白1（SAMHD1）是一种核苷酶，能够降解人类免疫缺陷病毒（HIV）基因组逆转录所需的脱氧核苷酸。相似地，最近发现的一类在细菌与真核生物之间保守的ATP核苷酶效应器能够裂解胞内的ATP和dATP，从而消耗核苷酸并抑制病毒复制。

核苷酸及核酸在宿主与病原体的相互作用中发挥核心作用，因此成为免疫反应的关键调节因子。当在真核细胞质中发现某些类型的核酸时，宿主会触发免疫反应。例如，像双链RNA（dsRNA）或双链DNA（dsDNA），这些病毒核酸在细胞质中被识别为“非自身”核酸分子。病毒dsRNA和dsDNA可分别被模式识别受体（如RIG-I样受体和STING/cGAS通路）识别，从而诱导I型干扰素（IFN-I）反应，这是一条核心的抗病毒防御途径。IFN-I基因编码的配体被分泌后，与细胞表面的IFN受体结合，并上调IFN刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs），其中包括SAMHD1，以协调系统的先天免疫反应并清除病毒感染。

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尽管干扰素和干扰素受体似乎是脊椎动物特有的，但最近在秀丽线虫的研究中发现了一种免疫反应通路，其激活方式与IFN-I反应的激活方式类似。这种免疫反应被称为胞内病原体反应（intracellular pathogen response，以下简称IPR），它涉及一组由线虫肠道内天然侵染的胞内病原体（例如Orsay病毒和微孢子虫）诱导激活的基因构成。具有组成型表达IPR的突变体可增强线虫对病毒和微孢子虫感染的抵抗力。与哺乳动物中RIG-I样受体在病毒感染时激活IFN-I类似，线虫中的RIG-I样受体DRH-1也可在病毒感染时激活IPR，尽管IPR和IFN-I反应中使用的转录因子具有差异性。有趣的是，IPR可以以系统性的方式被激活，这也是IFN-I反应的一个标志。

最近研究发现，嘌呤再利用代谢紊乱可触发人类IFN-I反应和线虫IPR。在保守的嘌呤再利用酶代谢路径中，例如像腺苷脱氨酶（adenosine deaminase，ADA）是从细菌到人类中都发挥作用，该途径用于回收嘌呤核苷酸，相较于重新合成新的嘌呤，这一途径更能体现生物对资源的利用率。值得注意的是，ADA作用于游离嘌呤，不同于作用于RNA的腺苷脱氨酶（adenosine deaminase acting on RNA，ADAR），后者是一种作用于核酸且为后生动物特有的酶，在先天免疫中发挥独立作用。最近在内皮细胞培养的研究中发现，通过小干扰RNA（siRNA）敲低人类嘌呤再利用酶ADA2，可将嘌呤腺苷和脱氧腺苷转化为肌苷和脱氧肌苷，并通过脱氧腺苷的积累导致上调IFN-I反应。这些在体外细胞培养的研究发现与机体内情况的相关性及其对抗感染的影响机制尚不清楚，仍需通过ADA2突变进行分析验证。尽管如此，它们可能揭示人类ADA2突变引发炎症综合征（如Ⅰ型干扰素病）的病因：这些突变可能触发IFN-I配体的转录以及下游信号的过度活跃。值得注意的是，在嘌呤核苷磷酸化酶（purine nucleoside phosphorylase，PNP）突变的人群中，也观察到IFN-I增加和炎症综合征。另一方面，PNP以及其他人类ADA突变，即ADA1，会导致免疫缺陷。总之，多种嘌呤再利用酶的突变会导致复杂的免疫系统失调，其潜在机制仍有待深入研究。

在Emily Troemel团队早期研究中，通过无偏正向遗传筛选鉴定IPR的负调控因子，结果发现嘌呤再利用酶PNP-1是IPR的负调控因子。他们证明，pnp-1(lof)可诱导IPR基因表达，并增强对病毒和微孢子虫感染的抵抗力。此外，他们发现在线虫免疫中起关键作用的是定位于肠上皮细胞，因为线虫缺乏像巨噬细胞这样的专业免疫细胞。这些关于pnp-1的发现表明，嘌呤代谢物的紊乱激活了IPR，但尚不清楚其他哪些嘌呤再利用酶可能参与这一效应，也不清楚在这些突变体中，是否有嘌呤代谢物发生失调，从而诱导线虫的免疫反应。

本研究中，Emily Troemel团队进一步发现在线虫中一个之前未明确功能的基因C06G3.5，该基因编码一种腺苷脱氨酶（ADA）。因此，文章将其命名为ADA同源基因adah-1，并发现它是IPR的负调节因子。通过RNA干扰（RNA interference，RNAi）或由经CRISPR/Cas9基因编辑系统介导的敲除adah-1缺失突变体，均可上调IPR基因表达，并增强对病毒和微孢子虫感染的抵抗力。与pnp-1不同，adah-1突变体会在线虫早期发育停滞，因此adah-1是一个必需基因。此外，adah-1似乎在多种组织中均有表达，而在肠道中发挥调节IPR基因表达和抗感染能力的作用。通过检测受pnp-1和adah-1酶催化的不同嘌呤代谢物中，作者发现脱氧腺苷（一种ADA的底物）可诱导IPR，并增强对细胞内感染的抵抗力。文章还将这些关于抗感染的发现扩展到人类内皮细胞。综上所述，文章的研究结果表明，嘌呤再利用酶PNP或ADA的缺失会导致嘌呤代谢物脱氧腺苷的积累，进而激活线虫肠道中的免疫基因表达和病原体抵抗。相关的研究结果发表在iScience（IF=4.6）上，以下就由小编和大家详细解读其中的研究过程。

ADA/ADAH-1负调控pals-5p::GFP报告基因表达，其对线虫发育是必需的

基于研究团队之前的研究结果，即嘌呤再利用酶PNP-1是IPR的负调控因子，作者通过RNAi敲低了预测编码嘌呤再利用途径中其他酶的八个基因，以确定哪些基因也可能调控IPR。作者使用pals-5p::GFP（ERT54 jyIs8 [pals-5p::GFP + myo-2p::mCherry] X，pals-5是诱导IPR程度最高的基因之一）作为诱导IPR的读取报告基因，发现之前未明确功能的基因C06G3.5的RNAi可诱导pals-5p::GFP表达，这与pnp-1(RNAi)相似（图1A-C）。基于C06G3.5与其他生物中ADA的序列同源性，文章将其命名为ADA同源基因adah-1。据预测，ADAH-1是嘌呤再利用途径中PNP-1上游的酶。由于其他IPR触发因素（如pnp-1突变）诱导pals-5p::GFP需要bZIP转录因子ZIP-1，正如上文研究PNP-1所述，本文验证adah-1(RNAi)诱导pals-5p::GFP表达是否依赖ZIP-1。试验结果显示，在zip-1突变体中，adah-1(RNAi)不再诱导pals-5p::GFP表达。因此，与pnp-1缺失诱导相似，ZIP-1对于通过adah-1负调控pals-5p::GFP报告基因是必需的。

为了确认adah-1的缺失会诱导pals-5p::GFP的表达，作者利用CRISPR/Cas9技术在pals-5p::GFP背景下完全敲除adah-1基因，构建null等位基因adah-1(jy125)，文章将其简称为“-”。作者发现，adah-1(-/-)纯合突变体在幼虫发育L3阶段停止发育。尽管adah-1(-/-)纯合突变体在发育过程发生终止，但仍然可明显观察到上调表达pals-5p::GFP报告基因。另外，作者对基因型adah-1(+/-)杂合线虫的子代进行基因型鉴定和表型评估，以便进一步将adah-1突变基因型与pals-5p::GFP表达表型相关联，并研究该敲除等位基因是否为完全隐性表型。试验结果显示，所有具有pals-5p::GFP表达的子代都是adah-1(-/-)突变纯合子，而所有没有pals-5p::GFP表达的线虫要么是adah-1(+/-)杂合子，又或是adah-1(+/+)野生型。总之，对于组成型pals-5p::GFP表达，adah-1的敲除突变体是完全隐性基因。由于adah-1的敲除导致线虫发育停滞，作者使用nT1[qIs51]平衡子生成adah-1(+/-)杂合品系，以便使该线虫品系得到保存。与前面的试验结果一致，作者发现pals-5p::GFP诱导表达仅出现在adah-1(-/-)纯合突变子中，而在adah-1(+/-)杂合子或adah-1(+/+)野生型中则没有（图1D–1F）。因此，adah-1(lof)似乎导致幼虫致死和pals-5p::GFP表达上调表型的完全隐性基因。

接下来，作者尝试在adah-1(-/-) null突变体中引入游离的adah-1a cDNA染色体转基因（adah-1p::adah-1::mScarlet，adah-1OE）来挽救其表型。为了确定此转基因是否将adah-1(-/-)突变体中的pals-5p::GFP表达恢复到野生型水平，作者在L1/L2阶段比较有无转基因的突变体中的pals-5p::GFP表达水平，因为adah-1(-/-)突变体在此阶段发育停滞。试验结果发现与没有转基因的adah-1(-/-)突变体相比，携带adah-1OE的adah-1(-/-)突变体（adah-1(-/-); adah-1OE）中的pals-5p::GFP表达水平显著降低（图1G–1I）。此外，作者发现，adah-1(-/-); adah-1OE线虫能够发育成成虫，表明adah-1OE挽救了adah-1突变体的发育停滞表型（图1J）。也就是说，adah-1(-/-)突变体在发育到L4阶段前便发育停滞了，但adah-1(-/-); adah-1OE线虫能正常发育，且与野生型对照组相当（图1K）。总之，这些试验结果展示了adah-1缺陷线虫会上调pals-5p::GFP报告基因的表达，并且adah-1对于幼虫发育至关重要。由于adah-1(-/-)突变体的这些发育的影响，鉴于adah-1(-/-)突变体对发育的影响，后续研究采用RNAi方法探究adah-1在IPR调节及免疫中的功能。

接下来，作者比较了adah-1缺陷型与pnp-1缺陷型线虫中pals-5p::GFP的表达水平。在典型的嘌呤再利用路径中，adah-1和pnp-1存在上下游关系，这将在文章的下文中关于线虫代谢组学研究中进一步证实。首先，作者发现adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)均导致pals-5p::GFP表达产生相似程度的增强，并且pnp-1(RNAi)影响小于pnp-1(lof)，这与RNAi仅导致部分功能丧失表型一致。接着，作者在pnp-1(lof)中进行了adah-1(RNAi)。结果显示，在pnp-1(lof)中，adah-1(RNAi)仅导致pals-5p::GFP表达增加约1.5倍，而在野生线虫中，pals-5p::GFP表达增加约2.5倍。这些发现表明，与pnp-1相比，adah-1在IPR调节中可能发挥更大的作用。实际上，前文所述，与pnp-1相比，adah-1在发育过程中也具有更重要的作用。总之，pnp-1和adah-1均作为IPR基因表达的负调节因子，并存在上下游关系相一致。

图1 adah-1调节pals-5p::GFP表达并且对于幼虫发育是必需的

转录组分析表明adah-1(RNAi)诱导IPR基因表达

上文中我们提到本研究是基于报告基因pals-5p::GFP来判断IPR的诱导情况，文章接下来研究了adah-1(RNAi)后内源性IPR的相关基因表达情况，以确定adah-1(RNAi)处理后是否会产生与已证实的pnp-1缺失导致的IPR基因表达增加相似的效果。首先，作者使用RT-qPCR比较pnp-1(RNAi)或adah-1(RNAi)处理的线虫与L4440(RNAi)对照组处理线虫的IPR基因表达情况。文章中pnp-1和adah-1的mRNA均显著降低，这证实了RNAi的效果（图2A）。此外，作者发现两种RNAi处理均显著诱导pals-5和其他IPR基因的表达（图2A）。这些关于pnp-1(RNAi)的发现与已知的pnp-1突变体的研究结果是相似的，这表明adah-1(RNAi)在诱导这一亚组IPR基因的mRNA表达方面与pnp-1(RNAi)具有相似的影响。

文章对adah-1(RNAi)引起的全转录组变化进行RNAseq，将adah-1(RNAi)、pnp-1(RNAi)与空载体L4440(RNAi)处理的对照线虫的转录组数据进行比较。差异基因表达分析显示，与空载体对照相比，经adah-1(RNAi)处理的线虫中有51个基因显著上调，而经pnp-1(RNAi)处理的线虫与对照组相比有20个基因上调。然后，文章将这些基因集合与80个典型的IPR基因（这些基因是线虫被微孢子虫侵染后上调基因以及另一个IPR负调节因子pals-22突变体上调基因的共同集合）进行了比较。文章发现经adah-1(RNAi)处理的线虫中上调的51个基因中有34个，以及经pnp-1(RNAi)处理的线虫中上调的20个基因中有16个与IPR典型基因重叠（图2B）。另外，作者还将经pnp-1(RNAi)或adah-1(RNAi)处理上调的基因与pnp-1(jy90)突变体中上调的基因进行比较，发现所有在经adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)处理的线虫中上调的基因也在pnp-1(jy90)突变体中上调（图2C）。此外，文章还adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)上调的基因与pals-22(jy3)突变体中上调的基因进行比较，发现三者之间具有显著的重叠（图2D）。值得注意的是，与pnp-1突变体相比，作者发现通过pnp-1(RNAi)挖掘出的上调基因更少（图2C），这可能是由于与突变相比，RNAi对基因功能的影响更小。尽管如此，上述的RNAseq数据表明，adah-1或pnp-1的缺失都会导致类似的IPR基因上调，这也表明adah-1与pnp-1一样，在诱导IPR基因表达中起到负调节因子的作用。

为了分析pnp-1和adah-1调控的基因类别与已研究的其他IPR触发因素上调的基因之间的关系，作者进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA，图2E）。作者发现adah-1(RNAi)线虫上调的基因与自然肠道病原体N. parisii和Orsay病毒侵染线虫后上调的基因显著重合，另外Orsay病毒RNA1片段异位表达诱导的基因也是显著重合的（图2E）。Orsay病毒RNA1编码一种活性RNA依赖性RNA聚合酶，该酶通过病毒RNA传感器DRH-1/RIG-I激活IPR。此外，adah-1(RNAi)还上调了由其他IPR触发因素（如蛋白酶体抑制剂硼替佐米和热应激）以及pnp-1和pals-22突变体中上调的基因（图2E）。总之，这些分析结果支持嘌呤在利用酶ADAH-1作为IPR的负调节因子的作用，其在基因表达方面的影响与已研究的嘌呤再利用酶pnp-1类似。

图2 adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)诱导内源IPR基因表达

代谢组分析表明ADAH-1是一种经典的腺苷脱氨酶

接下来，文章继续探讨ADAH-1是否作为典型的ADA发挥作用，并处于PNP-1的上游起作用。ADA和PNP都是从细菌到人类都保守存在的嘌呤再利用途径中的酶，其中ADA在PNP的上游起作用，即ADA催化腺苷脱氨生成肌苷，然后再由PNP催化肌苷转化为次黄嘌呤（图3A）。作者团队之前使用液相色谱-质谱联用（LC-MS）对PNP-1进行的代谢组学分析证实，PNP-1可能表现为典型的PNP，因为研究中发现与野生型线虫相比，pnp-1突变体的肌苷水平升高，而次黄嘌呤水平降低。为验证ADAH-1的酶活性，作者以pnp-1(jy90)突变体为阳性对照进行LC-MS分析。结果显示，与野生型线虫相比，pnp-1(jy90)突变体的肌苷水平升高，次黄嘌呤水平降低，同时腺苷水平升高（图3B）。然后，作者发现针对adah-1(RNAi)处理中显著提高了腺苷水平，并降低了肌苷和次黄嘌呤水平，这与如果ADAH-1催化典型的ADA反应所预期的结果一致的（图3C）。因此，ADAH-1明显是一种真正的ADA，在嘌呤再利用途径中作用于PNP-1的上游。

图3 代谢组分析adah-1和pnp-1缺陷线虫中嘌呤代谢水平

补充脱氧腺苷诱导IPR基因表达

通过上文解读我们知道，adah-1和pnp-1缺陷型线虫体内嘌呤代谢物的水平发生了变化，这表明这些代谢物中的一种可能调节IPR。因此，作者设想补充ADAH-1和PNP-1活性的前体或产物的嘌呤代谢物是否可能调节IPR基因的表达？在自其他生物中，ADA和PNP不仅作用于RNA形式（腺苷和肌苷），还作用于DNA形式（脱氧腺苷和脱氧肌苷），而这些化合物在细胞中的含量通常要低得多，作者在进行含量分析是发现它们低于LC-MS可检测水平。因此，作者决定在线虫的食物中添加30 mM腺苷、脱氧腺苷、肌苷、脱氧肌苷和次黄嘌呤，然后量化pals-5p::GFP的表达。值得注意的是，大肠杆菌是线虫在实验室培养的常规食物来源，已有研究表明大肠杆菌会干扰饮食补充试验，因此作者采用热灭活的大肠杆菌作为饮食补充实验中线虫的食物来源。作者发现补充脱氧腺苷24小时后可显著诱导pals-5p::GFP报告基因的表达，而腺苷和脱氧肌苷的影响较小（图4A）。接下来，作者又进一步进行剂量反应曲线测量，在用不同浓度的脱氧腺苷补充时测量pals-5p::GFP的表达，发现随着脱氧腺苷剂量增加到90 mM，pals-5p::GFP的表达增加（图4B和4C）。这表明脱氧腺苷可激活IPR报告基因pals-5p::GFP的表达。

已知添加30 mM脱氧腺苷能显著诱导pals-5p::GFP表达，意思作者使用该浓度进一步探索脱氧腺苷对IPR影响。首先，为了研究脱氧腺苷对内源性IPR基因表达的影响，作者在使用30 mM脱氧腺苷处理线虫后进行RT-qPCR检测，发现与对照组相比，pals-5和其他IPR基因的表达水平均有所上升（图4D）。如果脱氧腺苷像病毒和微孢子虫感染等其他触发因素一样激活IPR，那么作者预计这种诱导将依赖于上文中我们提到转录因子ZIP-1。试验结果也正如作者所预期的，作者发现，zip-1突变体中添加30 mM脱氧腺苷未能诱导pals-5p::GFP表达，表明ZIP-1是脱氧腺苷作用的必需因子，而在野生型线虫中，添加脱氧腺苷则成功诱导pals-5p::GFP报告基因的表达（图4E）。因此，脱氧腺苷能诱导内源性IPR基因的表达且该过程涉及转录因子ZIP-1。

为验证pnp-1和adah-1缺失通过脱氧腺苷积累诱导IPR的机制，作者通过抑制核糖核苷酸还原酶（RNR）活性构建线虫模型。RNR在DNA合成中的关键作用，其可将用于合成RNA的核糖核苷酸原料转化为用于合成DNA的脱氧核苷酸原料。由于线虫基因组中存在多个RNR同源物，因此作者采用药物法，即RNR特异性抑制剂fludarabine。鉴于adah-1作为必需基因的操作难度，以及药物处理与饲喂RNAi细菌同时使用过程的复杂性，文章将重点关注于使用pnp-1突变体进行药物干预试验。如果pnp-1突变体中诱导IPR是由于脱氧腺苷的积累，那么经药物干预后会降低的脱氧核苷酸会压制pals-5p::GFP的表达。试验结果显示fludarabine处理后pnp-1突变体中的pals-5p::GFP确实表达显著降低（图4F和4G）。这一发现支持了pnp-1和adah-1缺陷型线虫中脱氧腺苷的积累是诱导IPR基因表达的原因。

为了进一步验证adah-1和pnp-1缺陷型线虫中，脱氧腺苷的积累是导致IPR诱导的原因，作者在adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)线虫中做进一步试验，即向RNAi处理的线虫中添加30 mM的脱氧腺苷，并测量pals-5p::GFP的表达。结果显示在RNAi已经诱导的基础上，脱氧腺苷的补充进一步增加pals-5p::GFP的表达。这种其中的原因可能是由于与null突变体相比，RNAi仅导致的部分基因功能丧失。与上述观察的结果一致的是，在pnp-1突变体中，经脱氧腺苷处理后，作者并未发现pals-5p::GFP的表达进一步增加。这也进一步印证可能是由于RNAi处理并不能使基因功能完全丧失，而突变导致的表型更为强烈。又或者说，这种无明显效果的原因可能是由于与RNAi处理相比，突变线虫的已形成长期的适应特性以及对脱氧腺苷作用的可能产生脱敏效应。综上，脱氧腺苷积累是嘌呤再利用酶缺陷线虫中IPR激活的关键诱因。

图4 补充脱氧腺苷诱导IPR基因表达

通过adah-1(RNAi)和补充脱氧腺苷可增强对胞内病原体抗性

接下来，本研究探讨了与IPR诱导有关的表型，即adah-1(RNAi)是否会增强对胞内病原体的抗性。首先，作者测量线虫被感染Orsay病毒后的抗性。文章通过使用荧光原位杂交（luorescence in situ hybridization，FISH）染色检测Orsay病毒RNA，作者发现adah-1(RNAi)和pnp-1(RNAi)以及阳性对照pnp-1(jy121)中病原体载量降低（图5A）。随后，作者再通过量化孢质（寄生虫细胞，它们在被感染L1阶段的线虫中首个标志可被检测）来测量感染微孢子虫病原体N. parisii后 3小时的抵抗力。与之前相关研究结果一致，pnp-1(RNAi)和pnp-1(jy121)的病原体载量显著降低（见图5B）。重要的是，作者发现adah-1(RNAi)也降低了N. parisii的病原体载量。通过测量肠腔内荧光的积累率，作者判断adah-1(RNAi)条件并未损害幼虫发育，也未影响摄食率，也就是并非通过降低喂食影响病原体感染。总之，上述试验结果表明，当线虫肠道感染天然胞内病原体时，adah-1缺陷型线虫对病原体抵抗力增强，表现为病原体载量降低。

病原体载量的降低可能与感染后存活率的提高有关，这通常被称为病原体耐受性或疾病耐受性。因此，作者接下来检测adah-1和pnp-1基因敲降后是否会提高线虫感染后的存活率。由于Orsay病毒不会杀死线虫，所以文章的重点关注能杀死线虫的N. parisii感染后存活率。与之前的研究结果一致，pnp-1突变体在N. parisii感染后提高存活率。另外，经pnp-1(RNAi)处理的线虫存活率也有所提高，而经adah-1(RNAi)处理的线虫则没有，这可能是因为与pnp-1缺失相比，adah-1缺失对线虫健康的影响更大。正如前文介绍，adah-1是一个关键基因，而pnp-1则不是。因此，很可能是因为adah-1(RNAi)在未感染的情况下会导致整体健康状况下降，这种影响抵消了免疫力提高带来的益处，从而导致经adah-1(RNAi)处理的线虫与对照组在感染后的存活率相似。

IPR是一种在野生型、未感染线虫体内并不活跃的免疫程序，但它可以通过感染如Orsay病毒或N. parisii，或通过缺失如adah-1和pnp-1等酶而被激活。鉴于在野生型未感染线虫中，IPR处于关闭状态，因此作者设想adah-1的过度表达不会降低IPR或对感染的抵抗力。在野生型背景下，adah-1的过度表达并不会引起病原体抗性的变化。值得注意的是，相同的adah-1表达质粒可以挽救adah-1的突变（见图1G–1K），这表明该质粒是具有功能的。综上所述，在野生型背景下，adah-1过度表达无显著效果，即IPR在正常、未感染条件下是关闭的，但可以通过缺失adah-1来诱导激活。

接下来，文章探讨脱氧腺苷补充后线虫对病原体抵抗力的影响，因为该处理引起的IPR基因诱导类似于adah-1的缺失。首先，作者将线虫暴露于脱氧腺苷中24小时，随后用Orsay病毒感染它们，并使用FISH技术针对Orsay病毒RNA测定病原体载量。作者发现与对照处理线虫相比，补充30 mM脱氧腺苷后Orsay病毒载量显著降低（图5C）。随后，文章还检查了线虫对N. parisii的抗性。确切地说，作者将L4阶段线虫暴露于30 mM脱氧腺苷中24小时，然后用N. parisii感染，并在30小时后通过FISH染色测定N. parisii的分裂体（N. parisii的复制形式）的病原体载量。同样，作者观察到补充脱氧腺苷后N. parisii病原体载量显著降低（图5D）。作者发现，补充脱氧腺苷的线虫摄食率与对照组相比无显著差异。总之，这些结果表明脱氧腺苷水平升高可增加对细胞内病原体的抗性，这与在pnp-1和adah-1缺陷型线虫中嘌呤代谢物水平升高从而诱导IPR和增加病原体抗性的结果是一致的。

作者为了将在线虫中的发现扩展到人类感染研究中，为此文章开发了一种系统，以研究使用脱氧腺苷处理的人类细胞中微孢子虫病原体的载量。文章采用先前已证实能够在脱氧腺苷处理后诱导IFN-I反应的人类脐静脉内皮细胞，并使用Encephalitozoon intestinalis感染这些细胞。Encephalitozoon intestinalis是一种微孢子虫，可引起人类的肠道感染。在感染之前，作者用递增剂量的脱氧腺苷处理脐静脉内皮细胞，发现这导致了病原体载量的降低，即对Encephalitozoon intestinalis的抗性增强（图5E）。为了确认这些效应是由于激活IFN-I反应造成的，作者用针对IFN-I受体IFN-alphaR1进行抗体处理，并发现病原体载量增加与对照组相比没有差异（图5F）。总之，上述的试验结果表明，脱氧腺苷处理通过IFN-I信号传导促进人类细胞对微孢子虫感染的抗性，该现象类似于脱氧腺苷处理通过IPR信号传导促进线虫对微孢子虫感染的抗性。

图5 通过adah-1(RNAi)和补充脱氧腺苷可增强对胞内病原体抗性

ADAH-1表达广泛并在肠道中调节IPR基因表达和病原体抗性

为了确定ADAH-1的表达模式，作者分析了表达带有mScarlet标签的ADAH-1（使用表达adah-1p::adah-1::mScarlet的转基因线虫），该线虫恢复了adah-1突变体的pals-5p::GFP表达和发育缺陷表型（图1G-1K）。因此，文章发现ADAH-1::mScarlet在线虫体内的多种组织中均有表达，包括肠道、表皮、神经元和体壁肌肉的组织（图6A）。由于肠道细胞的形态特征，使得它们很容易被识别。但其他组织则不太容易识别，因此作者通过与这些相应组织中表达的GFP报告基因共定位，证实ADAH-1::mScarlet在表皮、神经元和体壁肌肉中的表达。这些表明ADAH-1::mScarlet在表皮、神经元和肌肉中的表达，支持内源性adah-1在线虫多种组织中表达的模式。

鉴于上述ADAH-1::mScarlet的表达模式，作者还研究adah-1在哪个组织中的表达对于调节IPR是必需的。首先，文章使用具有RNAi缺陷型rde-1(ne300) null突变的品系进行组织特异性RNAi，该突变相较于之前描述的用于另一株组织特异性RNAi品系线虫rde-1(ne219)（该突变线虫保留部分的RNAi功能），泄漏更少。作者使用该品系，并与在组织特异性表达野生型rde-1品系线虫杂交，例如IG1839，其通过frSi17 [mtl-2p::rde-1 3’UTR] II在肠道中特异性表达野生型rde-1，以及IG1846，其通过frSi21 [col-62p::rde-1 3’UTR]在表皮中特异性表达野生型rde-1（并分别与N2野生型杂交生成ERT1265和ERT1266）。由于研究团队之前的相关工作表明，IPR可以在肠道和表皮中诱导，因此作者专注于线虫的这些组织。文章分别用对照、adah-1(RNAi)或pnp-1(RNAi)处理野生型、ERT1265或ERT1266品系线虫，以分别进行系统性、肠道特异性或表皮特异性的RNAi，然后测量pals-5p::GFP表达水平。研究团队之前的研究表明，在pnp-1突变背景下，肠道特异性表达pnp-1可以挽救IPR基因表达和病原体抗性表型，表明肠道中pnp-1的表达足以调节IPR表型。在本研究中，肠道中特异性pnp-1(RNAi)会导致pals-5p::GFP表达增加，说明肠道中pnp-1的表达对于调节IPR表型也是必需的。另外，作者同时发现肠道特异性adah-1(RNAi)诱导IPR报告基因，并与与全身性敲降相当，而表皮特异性adah-1(RNAi)导致pals-5p::GFP表达略有增加（图6B）。总体而言，上述发现表明，肠道或表皮中adah-1的缺失都会触发IPR基因的表达。

上述组织特性RNAi试验结果表明adah-1在肠道和表皮中对于调节病原体抗性至关重要。由于N. parisii病原体抗性表型是在L1阶段线虫中测量的，而该阶段过于年幼，无法观察到RNAi的效果，因此作者转而关注对Orsay病毒抗性的测量。在本研究中，作者从L1阶段到L4阶段，用pnp-1(RNAi)或adah-1(RNAi)处理野生型线虫，然后感染Orsay病毒，随后进行FISH染色以量化病毒载量。文章使用野生型线虫作为阳性对照，文章如预期的结果那样，adah-1或pnp-1的敲降均降低病毒载量（图6C）。于是，作者使用ERT1265品系进行肠道特异性RNAi，并发现adah-1或pnp-1的敲降均也可降低病毒载量。最后，作者使用ERT1266品系进行表皮特异性RNAi，并发现adah-1(RNAi)显著降低了病毒载量，而pnp-1(RNAi)则没有。与研究团队此前研究中仅在肠道和神经元中观察到的pnp-1相比，adah-1在表皮中的表达需求可能与其更广泛的表达模式有关系。总体而言，这些结果表明，在肠道或表皮中adah-1的缺失将诱导对胞内病原体的抗性。

在文章最后，作者使用adah-1组织特异性挽救试验验证adah-1在肠道中的表达足以调节IPR和线虫发育。作者采用adah-1挽救质粒，并通过肠道vha-6启动子或表皮dpy-7启动子驱动其表达，并将这些质粒分别引入adah-1突变体中。由于adah-1突变体无法发育成L4阶段，作者首先评估adah-1的组织特异性表达是否能使线虫正常发育。试验结果发现adah-1在肠道或表皮中的特异性表达足以挽救adah-1突变体的发育缺陷（图6D）。于是，作者测量这些菌株中的pals-5p::GFP表达，并再次发现adah-1在肠道或表皮中的特异性表达可压制adah-1突变体中增强的pals-5p::GFP表达水平至接近野生型（图6E）。因此，adah-1在肠道或表皮中的表达似乎足以挽救adah-1突变体的发育缺陷和压制pals-5p::GFP报告基因的表达。

图6 在肠道中表达的ADAH-1调节IPR和病原体抗性

总结

ADA和PNP是嘌呤再利用途径中的酶，它们存在于细菌到人类中。在人类中，这些酶的突变会引起复杂的综合征，涉及免疫缺陷和炎症。例如，已发现100多种不同的导致炎症性疾病的ADA2突变。在本研究中，作者首次对线虫中的ADA进行分析，并将其命名为adah-1，该基因编码蛋白质具有与其人类同源物相同的酶活性，可催化腺苷转化为肌苷。同时文章验证了adah-1的缺失会导致与下游酶pnp-1缺失产生相似的免疫表型，包括上调的免疫基因表达和对胞内病原体的抗性。重要的是，文章确定脱氧腺苷的积累可能是pnp-1和adah-1缺陷线虫出现免疫表型的可能原因（图7）。补充ADA的底物脱氧腺苷足以诱导线虫的免疫基因表达和病原体抗性，并将这一发现也扩展到了人类细胞。

图7 嘌呤再利用酶和脱氧腺苷在胞内病原体抗性中的作用模式

参考文献：Wernet, N. D., Tecle, E., Sarmiento, M. B., Kuo, C. J., Chhan, C. B., Baick, I., Batachari, L. E., Franklin, L., Herneisen, A., Bhabha, G., Ekiert, D. C., Hanna-Rose, W., & Troemel, E. R. (2025). Adenosine deaminase and deoxyadenosine regulate intracellular immune response in C. elegans. iScience, 28(3), 111950. https://doi.org/10.1016/j.isci.2025.111950发布于：福建省